一、項目名稱：黃芪多糖對樹突狀細(xì)胞分化和功能的影響及抗腫瘤免疫機(jī)制的研究
二、研究工作對浙江經(jīng)濟(jì)、社會和科技發(fā)展的意義
多糖具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤作用，且無毒副作用或毒副作用較小，是一類很有開發(fā)價值的抗腫瘤天然藥物。樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DC）是功能^強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞（Antigen presenting cells, APC），參與抗原的攝取、加工及提呈，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動者，在誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答過程中具有獨(dú)特的地位，由于它在機(jī)體的抗感染免疫及抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用極其重要而備受重視，成為近年來免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。
黃芪是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益類中藥，味甘、性溫，含有多種生物活性物質(zhì)，其中黃芪多糖對機(jī)體免疫活性的調(diào)節(jié)功能尤為突出，它能夠提高細(xì)胞免疫及體液免疫，并對一些細(xì)胞因子具有一定的調(diào)節(jié)作用。
我國作為中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)源國和中藥大國，有著深厚的中藥理論基礎(chǔ)，開發(fā)中藥多糖藥物具有獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的發(fā)展前景。我國傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代化技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系的建立是中藥走向世界的一個重要步驟，也是中藥發(fā)展所必須解決的一個重要問題。在《中國未來20年技術(shù)預(yù)見研究》——生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)課題中就指出將“采用基因表達(dá)指紋圖譜、化學(xué)成分指紋圖譜或生物活性指紋圖譜進(jìn)行新型中藥的開發(fā)”，所以對中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究，建立完整的中藥多糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的指標(biāo)體系是^重要的。真菌多糖類藥物的開發(fā)已有了較多的產(chǎn)品，而高等真核類生物多糖類藥物的開發(fā)卻鮮見報道，對它們的作用機(jī)制的分析也不夠完整。不同的多糖由于其分子結(jié)構(gòu)的不同，其在抗原提呈細(xì)胞上的受體和產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也有所不同，研究黃芪多糖不同分子量的組分對DC功能以及抗腫瘤作用的影響，初步揭示DC在黃芪多糖抗腫瘤免疫中所起的作用及其作用機(jī)制，不僅具有良好的原創(chuàng)性和學(xué)術(shù)前沿性，而且為黃芪多糖抗腫瘤藥物的開發(fā)，開拓國際市場奠定理論基礎(chǔ)。浙江省為全國著名的經(jīng)濟(jì)大省，具有很強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)勢力，百年老店胡慶馀堂和青春寶集團(tuán)都是全國著名的中藥企業(yè)，為浙江省中藥事業(yè)的發(fā)展作出了重大的貢獻(xiàn)，并產(chǎn)生良好的社會效益，所以開發(fā)黃芪多糖類藥物，研究其作用機(jī)制，這對浙江中藥經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有一定的推動作用，并將產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。研究和建立黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)功能的指紋圖譜，對其它抗腫瘤多糖類藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定等都具有重要的意義。
三、本項目研究目標(biāo)及與申請者研究工作長期目標(biāo)的關(guān)系；
- 項目研究目標(biāo)：闡述黃芪多糖對小鼠骨髓來源DC功能的影響，以及與抗腫瘤免疫的關(guān)系；建立黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)功能的指紋圖譜。
- 申請者長期從事免疫學(xué)領(lǐng)域的研究，是浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科的主要成員，在中藥組分的分離、制備以及免疫功能調(diào)節(jié)方面進(jìn)行了多年的研究，并發(fā)表了多篇研究論文。項目申請者和項目組的其他成員近年來對一些中藥組分（特別是中藥多糖）的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了較全面的篩選和初步研究，發(fā)現(xiàn)了一些組分具有比較特殊的免疫調(diào)節(jié)功能，黃芪多糖就是其中的一種，該項目的研究成果對其它中藥組分的功能研究也具有較好的推動作用。項目組的主要成員為浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科的主要成員，主要的工作目標(biāo)就是通過幾年的研究積累，爭取獲得國家中醫(yī)藥的重點(diǎn)學(xué)科。所以本項目研究目標(biāo)及與申請者研究工作長期目標(biāo)是一致的。
四、項目研究內(nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排
（一）、項目研究內(nèi)容：
- 體外實(shí)驗(yàn)研究黃芪多糖與DC的結(jié)合情況，研究黃芪多糖對DC的表面分子和細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以及DC表面黃芪多糖的受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
- 確定不同分子量的黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)功能的差異及相關(guān)的生物活性指紋圖譜。
- 整體動物實(shí)驗(yàn)研究黃芪多糖對小鼠多種免疫指標(biāo)（細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫和細(xì)胞因子分泌）及抗腫瘤活性的關(guān)系。
（二）、研究方法、技術(shù)路線及實(shí)驗(yàn)手段：
1. 小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和純化：脫臼處死6-8周齡 C57BL/6j(H-2b)小鼠，頸椎，取出股骨和脛骨，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，1000-1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用PBS洗三遍后重懸于含30ng/ml GM-CSF 、20ng/ml IL-4以及10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，接種于6孔板，三天后，吸掉未貼壁的細(xì)胞、換液。第五天，采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)純化樹突狀細(xì)胞。
2. 黃芪多糖與DC的結(jié)合：用熒光物質(zhì)2-氨基吖啶酮標(biāo)記黃芪多糖，在激光共聚焦顯微鏡下觀察黃芪多糖與DC的結(jié)合情況；
3. 流式細(xì)胞儀分析黃芪多糖對DC表面標(biāo)志分子表達(dá)的影響：收集純化并經(jīng)藥物處理24 h后的DC，F(xiàn)ACS緩沖液（含2％FCS和0.1％疊氮鈉的PBS）洗兩遍，于4℃下用10％的羊血清封閉細(xì)胞表面抗體15分鐘，然后加入PE標(biāo)記的抗MHCⅡ（I-A/I-E）單克隆抗體和FITC標(biāo)記的抗CD11c單克隆抗體，于4℃下溫育30分鐘，用FACS緩沖液洗三遍，然后用200μl FACS緩沖液重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀上檢測。
